近日，南京中医药大学谭仁祥教授团队在国际知名学术期刊Angew. Chem. Int. Ed.（IF: 15.336）在线发表题为 “Alteration of the Catalytic Reaction Trajectory of a Vicinal Oxygen Chelate Enzyme by Directed Evolution” 定向进化改变邻氧螯合酶催化的反应轨迹的研究成果。
邻氧螯合（VOC）家族酶可催化多种反应。其中，双加氧酶如外二醇双加氧酶（EDOs)、内二醇双加氧酶（IDOs)可以催化芳香族化合物的环裂解，在好氧生物降解中发挥关键作用，对于维持全球碳循环以及环境保护具有重要意义。但目前为止，仍缺乏一个合适的平台来调控此类双加氧酶的反应类型，尤其对于邻苯醌代谢通路的反应轨迹，研究甚少。
谭仁祥课题组前期在研究抗肿瘤化合物chartreusin生物合成过程中发现，双加氧酶ChaP可催化含邻苯醌基团的底物chartrequinone氧化重排形成chartreusin。系统发育树分析显示，ChaP属于VOC家族的新分支，在催化机制上与EDOs及IDOs相差较大，但其作用底物与儿茶酚有一定相似性。有研究报道，通过蛋白氨基酸突变，可实现EDOs和IDOs的互相转变。受此启发，定向进化被应用于ChaP 的人工改造。
首先，本文基于组合活性中心饱和测试（CAST）和迭代饱和诱变（ISM）原则，通过大规模建库及随后的体外酶促反应验证，成功筛选到可将chartrequinone转化为chatric acid A 的最优突变株ChaPD49L/Y92A、 ChaPD49L/Y92G、 ChaPD49L/Y92T 和 ChaPD49L/Y92S，其转化率高达95%，这彻底改变了ChaP原有的催化模式。在此基础上，通过去卷积实验，作者确定49位天冬氨酸突变成亮氨酸是ChaP催化反应类型转变的开关，其余突变位点与之的作用效应是协同而并非累加。为了更详细地洞察机理，作者对筛选到的突变株进行了蛋白晶体培养。由此获得了关键突变体 ChaPD49L、双突变ChaPD49L/Q91C及ChaPD49L/Y109F的蛋白晶体结构。接下来，作者通过计算模拟进一步探讨反应机制，一定程度上解释了底物chartrequinone在ChaP和ChaPD49L催化下形成不同产物的分布。除此之外，结合氧同位素标记、自由基验证、低温捕获中间体、chartrequinon类似物17-hydroxy-Chq酶促反应等实验，作者对ChaP突变株催化chartrequinone生成chatric acid A的反应机制进行了推测。
综上，作者开发了一个平台，可以控制邻氧螯合家族酶的催化反应轨迹。 这项研究加深了大众对邻氧螯合家族酶的理解，并扩大了它们的绿色催化库，从而为重新利用这些具有应用潜力的加氧酶提供了范例。
VOC家族系统发育树及ChaP定向进化策略
文章第一作者为南京中医药大学中药品质与效能国家重点实验室（培育）副教授王以爽、博士研究生郑婉、硕士研究生金允侠及南京医科大学副教授蒋南，通讯作者为谭仁祥教授和朱家鹏教授，南京中医药大学为第一通讯单位。该研究得到国家自然科学基金项目（81991524、82003608）和江苏省自然科学基金项目（BK20211254）资助。
